PHD theses : Science
Permanent URI for this collectionhttps://repository.neelain.edu.sd/handle/123456789/12104
Browse
Item Anti-inflammatory and antioxidant activities of extracts of callus and intact plant (rhizome) of ginger (Zingiber officinale Rosc.)(Al-Neelain University, 2019) Ammar Mohammed Ahmed AliAbstract The present study aimed to evaluate the in vitro antioxidant and anti-inflammatory activities and to investigate the chemical profile of extracts prepared from ginger (Zingiber officinale Rosc.) rhizome, callus and callus treated with different concentrations of chemical elicitors (yeast extract, glycine and salicylic acid). Callus, direct and indirect organogenesis of Z. officinale were induced on Murashige and Skoog (MS) medium fortified with different concentrations and combinations of plant growth regulators. Pieces of fresh weight (200 mg) of induced callus were transferred to MS medium supplemented with 0.5 mg/L of 2,4-D, then treated with different concentration of elicitors namely; yeast extract (100, 300 and 500 mg/L), glycine (100, 200 and 300 mg/L) and salicylic acid (50 and 100 mg/L) separately. Extraction of Z. officinale rhizome, callus and treated callus was carried out by maceration in petroleum ether (PE) and chloroform: methanol (1:1, v/v) (CM). Phytochemical studies were carried out by different chromatographic techniques and spectroscopy methods. Antioxidant activity was determined by 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) and 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) assays. Anti-inflammatory activity was investigated by evaluating the effect of rhizome and callus extracts on the activity of 5-lipoxygenase (5-LOX) enzyme and measure their effect on the inhibition of lipopolysaccharide (LPS)-induced production of pro-inflammatory cytokines as interleukin-1 (IL-1), interleukin-6 (IL-6), the tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) and enhancement the production of anti-inflammatory cytokine, interleukin-10(IL-10) and tumor growth factor-beta (TGF-β). The results of the present study revealed that, the highest significant value of callus fresh weight (1.302 ± 0.09g) was induced from shoot tip explants by MS medium+1.00 mg/L of 2,4-D, while a suitable concentration to regenerate callus by subculture was 0.5 mg/L 2,4-D. Direct organogenesis showed highest number of in vitro shoots and roots, 4±0.35 shoots and 15±0.46 roots per explants by MS medium+4.5 mg/L BAP. The best shoots and roots initiated by indirect organogenesis were 2±0.21 shoots and 22±0.33 roots on MS medium+ combination of 1.00 mg/L BAP+0.5 mg/L NAA. Preliminary phytochemical screening using thin layer chromatography (TLC) revealed the presence of phenols, terpenoids and flavonoids in PE and CM extracts of rhizome and phenols and terpenoids in callus extracts. The total phenolic content of callus was significantly affected (P<0.05) by the type and concentration of elicitors used. The highest significant increase (37%) in phenolic content was observed in callus treated with 100 mg/L yeast extract. HPLC analysis showed that 6-gingerol and 6-shogaol were found in both PE and CM extracts of ginger rhizome and were not detected in the callus extracts. Furthermore, gallic acid was only found in CM extracts of rhizome (34.05±0.39μg/mg) and callus (17.88±0.01μg/mg). Yeast extract, salicylic acid and glycine elicitors enhanced significantly (P< 0.05) the production of gallic acid in callus. The findings of GC/MS show for the first time that, the oil of ginger callus contained large amounts of fatty acids, mainly the unsaturated fatty acid oleic acid, methyl ester (31.11%) was 51-fold higher than that in rhizome oil (0.61%), and the saturated fatty acid palmitic acid, methyl ester (28.56%) recorded 10.65-fold higher than that in rhizome oil (2.68%). Furthermore, the oil of callus contained a remarkable level of steroids. On the other hand, callus treated with different concentrations of elicitors showed enhancement in the production of some bioactive compounds that were not detected in control. Treatment of callus with elicitors showed significant effects (P<0.05) in enhancing phenolic content and related antioxidant activity. Treatment of callus with yeast extract (100 mg/L), salicylic acid (50 mg/L) and glycine (200 mg/L) increased significantly (P<0.05) the antioxidant activity in DPPH assay by 34%, 30% and 29% respectively. All extracts of ginger rhizome and callus suppressed significantly (P< 0.05) the LPS-induced pro-inflammatory cytokine production of TNF-α, IL-1 and IL-6. Both callus extracts showed significantly (P<0.05) higher activity than the rhizome extracts. CM callus extract showed significantly (P< 0.05) higher capacity to suppress the IL-6 production. CM extract of ginger callus treated with elicitors showed significant (P<0.05) capacity to inhibit the production of pro- inflammatory cytokines (IL-1, IL-6 and TNF-α) at highest concentration used (100 μg/mL) when compared to control (untreated callus). Among all extracts estimated, PE extract of untreated callus had maximum 5-Lipoxygenase inhibitory effect (IC50 58.33±4.66 μg/mL), which was more than that was obtained by positive control Nordihydroguaiaretic acid (IC50 61.25±1.02 μg/ml). CM extracts of callus treated with elicitors enhanced significantly (P<0.05) the callus inhibitory effect on 5-Lipoxygenase activity. Treatment of callus with 100 and 300 mg/L yeast extract recorded highest inhibition levels against 5-Lipoxygenase activity where it was decreased by 33.16% and 25.46% respectively. In conclusion, studying the effect of elicitation on biosynthesis and accumulation of many types of plant secondary metabolites in in vitro ginger cultured tissues would be of immense importance for pharmacological, cosmetic and agronomic industries. Ginger callus extracts could be included in nutraceutical formulations where it could provide valuable protection against oxidation and inflammatory diseases. المستخلص هدفت هذه الدراسة لتقدير الفعاليات الحيوية المضادة للأكسده وللإلتهابات خارج الجسم الحي بالإضافة إلى دراسة المحتوى الكيميائي للمستخلصات المحضره من ريزوم وكالس والكالس المعامل بتراكيز مختلفه من المحرضات(مستخلص الخميره والجلايسين وحمض السالسيليك) لنبات الزنجبيل. كالس نبات الزنجبيل والأعضاء النباتية (المجموع الجذري والخضري) الناشئة بالطريقة المباشرة وغير المباشرة تم إستحثاث نموها على الوسط الغذائي موراشيج وسكوج(MS) المزود بتراكيز مختلفة من منظمات النمو النباتية. تم نقل قطع من الكالس النامي (200ملجرام) إلى الوسط MS المزود ب 0.5 ملجرام/لتر من 2,4-D والمعامل بتراكيز مختلفة من المحرضات; مستخلص الخميرة (100 و300 و500 ملجرام/لتر) & جلايسين( 100 و200 و300 ملجرام/لتر) & حمض سالسليك ( 50 و100 ملجرام/لتر) كلاً على حده. عملية الإستخلاص لريزومات النبات والكالس والكالس المعامل بتراكيز مختلفة من المحرضات تمت بواسطة عملية النقع في الإيثر البترولي (PE) ومحلول كلوروفورم:ميثانول (C:M) بنسبة 1:1 لمدة 72 ساعة. دراسة المحتوى الكيميائي النباتي تمت بواسطة تقنيات الكروماتوجرافيا المختلفة وطرق التحليل الطيفي. لتقدير الفعالية المضادة للأكسدة تم تنفيذ ذلك باستخدام طريقة DPPH و طريقة ABTS. تم تقييم الفعالية المضادة للإلتهاب في المستخلصات النباتية المحضرة بواسطة تقديرفعالية المستخلص على نشاط إنزيم 5-lipoxygenase (5-LOX) وكذلك أيضا قياس فعالية المستخلصات المحضرة على تثبيط إنتاج بعض السايتوكاينز المحفزة لعملية الإلتهابات مثل Tumor necrosis factor- alpha (TNF- α) Interleukin-1 (IL-1), Interleukin-6(IL-6),وتقدير فعالية المستخلصات النباتية المحضرة على تحسين إنتاج بعض أنواع السايتوكاينز المثبطة للعملية الإلتهابية مثل Interleukin-10 (IL-10) و Tumor growth factor-beta (TGF-β). أظهرت نتائج الدراسة أن أعلى وزن طري من الكالس (1.302±0.09 جرام) تم الحصول عليه من القمه الخضرية المستخدمة كمنفصل نباتي والمزروعة على الوسط الغذائي MS المزود ب 1.00ملجرام/لتر 2,4-D، بينما كان التركيزالمناسب لإكثار الكالس عن طريق إعادة الزراعة هو تركيز 0.5 ملجرام/لتر 2,4-D. أعلى عدد من الأعضاء النباتية الناشئة بالطريقة المباشرة كان4±0.35 أوراق و15±0.46 جذور للمنفصل النباتي النامي على الوسط الغذائي المزود ب 4.00 ملجرام/لتر ,BAP في حين سجل أكبر عدد من الأعضاء النباتية الناشئة بالطريقة غير المباشرة 2±0.21 أوراق و22±0.33 جذور للكالس النامي على الوسط الغذائي المزود ب1.00 ملجرام/لتر +BAP0.5 ملجرام/لتر NAA. نتيجة الفحص اللوني بطريقة الطبقة الرقيقة أظهرت وجود عدد من مركبات الآيض الثانوي النباتية مثل الفينولات والفلافونويدات والتربينات في مستخلص الإيثر البترولي ومستخلص كلوروفورم: ميثانول ريزوم الزنجبيل، كذلك أيضا وجود المركبات الفينولية والتربينات في مستخلصات الكالس. أثبتت الدراسة أن محتوى الكالس من المركبات الفينولية تأثر بشكل إيجابي وبفارق معنوي(P<0.05) بنوع وتركيز المحرضات المستخدمة. أعلى زيادة معنوية (37%) في المحتوى الفينولي للكالس كانت محسوبة في الكالس المعامل ب 100ملجرام/لتر من مستخلص الخميرة. أظهرت نتيجة التحليل باستخدام كروماتوغرافيا الأداء العالي HPLC وجود المركبات الأساسية الفعالة في نبات الزنجبيل 6-جنجيرول و 6-شوغول في كل من مستخلص الإيثر البترولي ومستخلص كلوروفورم:ميثانول الريزوم، بينما لم يسجل وجود لهذين المركبين في مستخلصات الكالس. أيضا حمض الجالليك وجد فقط في مستخلص كلوروفورم:ميثانول الريزوم (34.05±0.39μg/mg) و الكالس (17.88±0.01μg/mg). معاملة الكالس بمستخلص الخميرة والجلايسين وحمض السالسيليك حسنت وبفارق معنوي (P<0.05) إنتاج حمض الجالليك في الكالس. نتائج التحليل الكيميائي بإستخدام كروماتوغرافيا الغاز وطيف الكتلة GC/MS أظهرت ولأول مرة أن مستخلص الإيثر البترولي لكالس نبات الزنجبيل إحتوى على كميات عالية من الأحماض الدهنية وبشكل أساسي الاحماض الدهنية غير المشبعة مثل حمض الأوليك,ميثيل إسترOleic acid, methyl ester (31.11%) والذي كان أعلى ب51-ضعف مقارنةً بكمية الحمض نفسه المحسوبة في مستخلص الإيثر البترولي للريزوم (0.61%). الأحماض الدهنية المشبعة مثل حمض البالميتيك ,ميثيل إستر palmitic acid, methyl ester (28.56%) سجل 10.65-ضعف أعلى من ذلك المحتوى من نفس الحمض في مستخلص الإيثر البترولي لريزوم النبات(2.68%). مستخلص الإيثر البترولي للكالس إحتوى على كميات معتبرة من المركبات السترويدية والتي لم يسجل وجودها في مستخلص الإيثر البترولي لريزوم النبات. في نفس الوقت الكالس المعامل بتراكيز مختلفة من المحرضات أظهر تحسنا في إنتاج بعض المركبات الفعالة والتي لم يسجل وجودها في العينة الضابطة. معاملة الكالس بتراكيز مختلفة من المحرضات أثرت وبفارق معنوي (P<0.05) في رفع محتوى الكالس من المركبات الفينولية والذي نتج عنه تحسن في الفعالية المضادة للأكسدة. معاملة الكالس ب 100ملجرام/لتر مستخلص خميرة و 50ملجرام/لتر حمض سالسيليك و 200ملجرام/لتر جلايسين أدت الى رفع الفعالية المضادة للأكسدة وبفارق معنوي(P<0.05) في تجربة DPPH بنسبة 34% و30% و29% على التوالي. مستخلصات الريزوم أظهرت فعالية معنوية (P<0.05) لكبح إنتاج السايتوكاينز المحفرة للعملية الإلتهابية TNF-α, IL-1 & IL-6. مستخلصات الكالس سجلت فعالية مضادة لإنتاج السايتوكاينز المحفرة للعملية الإلتهابية أعلى وبفارق معنوي (P< 0.05) مقارنة بمستخلصات ريزوم النبات. مستخلصات كلوروفورم:ميثانول الكالس المحرض بتراكيز مختلفة من مستخلص الخميرة والجلايسين وحمض السالسيليك أظهرت فعالية مضادة لإنتاج السايتوكاينز المحفز للإلتهاب ( TNF-α, IL-1 &IL-6) عند تركيز 100 μg/mL أعلى وبفارق معنوي من فعالية مستخلص العينة الضابطة (الكالس غير المعامل بالمحرضات). من بين كل المستخلصات المختبرة مستخلص الإيثر البترولي للكالس أظهر أعلى تأثير مثبط لفعالية إنزيم 5-Lipoxygenase (IC50 58.33±4.66 μg/mL)مقارنة بالمستخلصات الأخرى وأعلى من ذلك التأثير الناتج عن مركب Nordihydroguaiaretic acid (IC50 61.25±1.02 μg/mL). مستخلصات كلوروفورم:ميثانول الكالس المعامل بتراكيز مختلفة من المحرضات حسنت وبفارق معنوي (P <0.05) تثبيط نشاط إنزيم 5-Lipoxygenase. الكالس المحرض ب100و300ملجرام/لتر من مستخلص الخميرة سجلت أعلى تأثيرضد فعالية إنزيم 5-Lipoxygenase بنسبة 33.16% و25.46% على التوالي. في الختام وبناءً على ماعرض من نتائج الدراسة فإن دراسة تأثير المحرضات على التخليق الحيوي للعديد من منتجات الآيض الثانوية في نبات الزنجبيل النامي في المختبر بتقنية زراعة الأنسجة النباتية يعتبر من الأهمية بمكان في مجال صناعة العقاقيرالصيدلانية ومواد التجميل والمنتجات الزراعية .حيث يمكن تقديم مستخلصات كالس الزنجبيل كمواد أولية لتحضير تشكيلات مختلفة من العقاقير الصيدلانية كمضادات للأكسدة وللإلتهابات.