علوم - دكتوراة
Permanent URI for this collectionhttps://repository.neelain.edu.sd/handle/123456789/511
Browse
2 results
Search Results
Item Molecular Genotyping of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus in Khartoum Teaching Hospital(Al Neelain University, 2009) Eidha Ali Awadh Bin HameedAbstract Introduction Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is a major problem in hospitals around the world. There is a growing concern about the rapid rise in resistance of nosocomial infections to antimicrobial agents. The aims of present study were to determine the frequency rate of infection of MRSA strains in Khartoum Teaching Hospital and to define the molecular genotyping of Staphylococcus aureus strains using polymerase chain reaction (PCR) and polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP). Materials and methods This is a cross-sectional study performed to detect the methicillin resistant S. aureus (MRSA) isolates collected from Khartoum Teaching Hospital during September 2005 and August 2007 by various molecular genotyping methods. The samples were collected from clinical wound specimens in the wards of surgery, orthopaedic and burns, then processed, cultured and subsequently susceptibility test was performed using disc diffusion method. Polymerase chain reaction (PCR) was used to amplify a sequence of the S. aureus specific gene, methicillin resistant (mecA) gene and coagulase (coa) gene. PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP) based on coagulase gene polymorphism was also evaluated by Alu1 restriction enzyme. Results Forty eight S. aureus isolates were collected and the number of MRSA identified was 9(18.75%). All strains of MRSA and MSSA were sensitive to vancomycin, while multi-drug resistance was observed to be common among MRSA strains. The isolates were classified into 3 groups; group І: S. aureus isolated from the surgical ward (No. =28; 58.3%), group ІІ: S. aureus isolated from the orthopaedic ward (No. =14; 29.2%), and group ІІІ: S. aureus isolated from the burns unit (No. =6; 12.5%). PCR amplification of the S. aureus specific gene produced at 107 bp of all isolates. mecA gene yielded the amplicon size at 1319 bp (9/48), and coa gene produced amplification products approximately at 500 bp (26/48), and 580 bp (22/48). Two distinct PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP) patterns of coagulase gene exhibited among isolates of S. aureus; coaA and coaB. With AluΙ restriction enzyme digested, the product fragments were approximately at 190, 310 bp and 190, 390 bp with percentages of 54.2% (26/48) and 45.8% (22/48) respectively. Conclusion Wound infections showed common multiple antibiotic resistant of MRSA. The PCR assay appears to be more reliable and accurate test for both the genus and the species of S. aureus, as well as for detection of MRSAPBP. PCR-RFLP represents a powerful, rapid, and reliable molecular genotyping system for detection of S. aureus in hospitals. The PCR assay appears to be more reliable and accurate test for both the genus and the species of S. aureus, as well as for detection of MRSA-PBP. PCR-RFLP represents a powerful, rapid, and reliable molecular genotyping system for detection of S. aureus in hospitals. الخلاصــــة مقدمــة تمثل جراثيم المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيللين (MRSA) مشكلة صحية كبيرة في جميع مستشفيات العالم. ووجد أن معدل انتشار مقاومة جراثيم المكورات العنقودية الذهبية للمضادات الحيوية في زيادة متسارعة وخصوصا في العدوى المكتسبة في المستشفيات، لذا هدفت هذه الدراسة لتحديد معدل تكرار الإصابة بجراثيم المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للمثيسيللين وتحديد أنماط انتشار حساسية المضادات الحيوية لهذه الجراثيم في مستشفى الخرطوم التعليمي في السودان، وتحليل النمط الجزيئي لهذه الجراثيم بواسطة اختبار تفاعل البلمرة التسلسلي (PCR) وتحديد الطول الجزيئي المحدد التبايني (PCR-RFLP). منهجيـة الدراســة هذه دراسة مقطعية لتشخيص جراثيم المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيلين (MRSA) المعزولة من مستشفى الخرطوم التعليمي في الفترة من سبتمبر 2005 إلى أغسطس 2007 م بطرق التنميط الجيني لمعرفة مصدر وانتشار العدوى المكتسبة بهذه الجراثيم. جمعت عينات جراثيم المكورات العنقودية الذهبية من أنواع مختلفة للجروح السريرية في أقسام الجراحة والعظام ووحدة الحروق بمستشفى الخرطوم التعليمي. جميع هذه العزلات تم تزريعها ودراسة حساسيتها للمضادات الحيوية بطريقة الانتشار من الأقراص. بالنسبة للخصائص الجزيئية للجينات فقد تحديدها بواسطة اختبار تفاعل البلمرة التسلسلي (PCR) للجين النوعي للمكورات العنقودية الذهبية (S. aureus specific gene) والجين المسئول عن وجود المقاومة للميثيسيلين (mecA gene) وجين إنزيم التلزن (coagulase gene)، أما الطول الجزيئي لإنزيم التلزن فتم تحديده بواسطة اختبار تفاعل البلمرة التسلسلي وتحديد الطول الجزيئي المحدد التبايني (PCR-RFLP) بواسطة الإنزيم القاطع Alu1. النتـــــائج تم عزل 48 من جراثيم المكورات العنقودية الذهبية بنجاح وتم التعرف على 9 منها كانت مقاومة للميثيسيلين وهي تمثل نسبة 18,75%. أظهرت النتائج أن جميع عزلات المكورات العنقودية الذهبية المقاومة والحساسة للميثيسيللين كانت حساسة للفانكومايسين، وأن المقاومات المركبة للمضادات الحيوية كانت شائعة في جراثيم الـ MRSA. قسمت جراثيم المكورات العنقودية الذهبية إلى 3 مجموعات: المجموعة الأولى من قسم الجراحة وعددها 28 (58.3%)، المجموعة الثانية من قسم العظام وعددها 14 (29.2%)، المجموعة الثالثة من وحدة الحروق وعددها 6 (12.5%). تفاعل البلمرة التسلسلي (PCR) للجين النوعي للمكورات العنقودية الذهبية (S. aureus specific gene) وجد عند 107 bp لجميع العزلات، والجين المسئول عن وجود المقاومة للميثيسيلين (mecA gene) وجد عند 1319 bp لعدد 9 عزلات، وجين إنزيم التلزن (coagulase gene) وجد تقريبًا عند 500 bp (26/48) و 580 bp (22/48). أما تفاعل البلمرة التسلسلي وتحديد الطول الجزيئي المحدد التبايني (PCR-RFLP) لإنزيم التلزن لجراثيم المكورات العنقودية الذهبية بواسطة الإنزيم القاطع AluI فقد وجد أن هناك نمطين coaA وcoaB عند 190, 310 bp و 190, 390 bp تقريبًا وبهذه النسب 54.2% (26/48) و 45.8% (22/48) على التوالي. الخلاصــة يستخلص من هذه الدراسة أن تكرار المقاومة والمقاومة المركبة للمضادات الحيوية لجراثيم الـ MRSA شائعة في الجروح الملتهبة. إن اختبار تفاعل البلمرة التسلسلي كان أكثر ثقة ودقة لتحديد الجينات المسؤلة عن الجنس والنوع لجراثيم المكورات العنقودية الذهبية بالإضافة إلى تحديد الجين المسئول عن المقاومة للميثيسيللين. يمثل فحص تفاعل البلمرة التسلسلي وتحديد الطول الجزيئي المحدد التبايني نظاماً أكثر ثقة ودقة للتنميط الجزيئي لجراثيم المكورات العنقودية الذهبية وانتشارها في المستشفياتItem Cytogenetic and Molecular Characterization of Disorders of Sex Development with special emphasis on SRY gene(Al Neelain University, 2011) Manal Mohammed Elhassan Awad ElkareemAbstract Introduction Disorders of sex development (DSD) refer to a group of congenital conditions in which the development of the chromosomal, gonadal and/or anatomical sex have been atypical. Worldwide, DSD has an incidence of 1:5000 live births, being more common in Jewish and Hispanic, but unfortunately there are no accurate records about the incidence of DSD in Sudan. Molecular studies of sex reversal patients by Sinclair and his group in 1990 had led to identification of the SRY gene and its role in male sex differentiation. Since that time and till now, the full spectrum of SRY gene mutations and the role of other autosomal genes were not fully understood. In the present study, we aimed to characterize the phenotype, and cytogenetic alterations in Sudanese patients with DSD. In addition to that, we aimed also to characterize SRY mutations associated with 46,XY DSD and to correlate the mutations with the clinical profile of the patients. Materials and methods A total of 60 patients referred with provisional diagnosis of DSD were enrolled in this study. Ten ml of venous blood were collected from each patient under complete aseptic conditions (5ml in sodium heparin container for cytogenetic analysis and another 5ml in EDTA container for DNA extraction). All patients signed a written consent that has been approved by Al Neelain University Ethical Committee prior the study. The lymphocyte culture, chromosomal analysis, and karyotype were performed according to the standard cytogenetic technique, and in accordance with ISCN guidelines (1995). Whereas genomic DNA was extracted using Guanidine Chloride method, detection of SRY gene was performed by polymerase chain reaction (PCR) using XES10 and XES11 primers. Reaction products were electrophoresed on 1% agarose –TBE gels and visualized with gel documentation system. Amplified region was directly sequenced in 19-46,XY-DSD-patients to identify and characterize mutations in SRY gene. Data were analyzed using SPSS 13 software. Descriptive statistics (frequencies and percentages) were obtained for categorical variables. Results Of the sixty patients examined, 65% grown up as females and 35% as males; age ranged between one month and 45 years. Of the 60 patients, 63.3% were presented after pubertal age while, 36.7% were accessible before puberty. Sixty percent of the patients have been referred due to their ambiguous genitalia, 30% due to primary amenorrhea, and the remaining 10% were due to other complains. The cytogenetic analyses showed that 46,XY karyotype was present in 61.7% of patients, 46,XX karyotype in 31.7%, and abnormal karyotype (46,XX/46,XY; 47,XYY; and 45,XO/46,XX) in 6.7%. In 61.7% of the patients, the sex of rearing was matching with correct genotype, whereas in 38.3% of the patients the results showed clashing between the sexes of rearing and the genotype. 33.3% of the patients had 46,XY karyotype and grown up as females, 75% of those have experienced female genital mutilation while 25% have not. According to the patient’s phenotypes, the phenotype was in complete accordance with the genotype in only 18.4% of the adult patients. The physical examination showed absent secondary sexual characteristics in 42.6% of the adult patients. XII SRY gene analysis showed physical presence of the gene in 60% of the cases, of which 51.7% had 46,XY, 5.0% had 46,XX, and 3.3% had mosaic karyotype (46,XX/46,XY). Complete absence of the SRY gene was seen in 40% of the patients, of which 26.6% had 46,XX, and 10% had 46,XY, and 1.7% had 47,XYY or 45,XO/46,XX karyotype. About 61.66% of the patients were diagnosed as 46,XY DSD, of those, 5% were finally diagnosed as Swyer syndrome and 3.33% as ovotesticular DSD. The result showed that 33.33% of the patients had the diagnosis of 46,XX DSD, of those, 5% had final diagnosis of complete gonadal dysgenesis (CGD), 6.7% had diagnosis of complete gonadal dysgenesis turner (CGD, Turner), ), 1.7% turn to be sex reversed with SRY gene translocation. The remaining patient (1.7%) was ovotesticular DSD. 5% of the patients were diagnosed as sex chromosome DSD. DNA sequencing of the selected samples revealed apparent single base changes in 7 cases, 5 different mutations were obtained, the detected mutations were not reported before. Two cases showed Heterozygous T to G transversion, at codon 71, resulting in Alanine (A) replacing Serine (S) in case of the mutant allele, this mutation lies inside the HMG box. Four cases showed Heterozygous G to A transition, at codon 132, resulting in Valine (V) replacing Alanine (A) in case of the mutant allele, this mutation lies inside the HMG box. Three cases showed Heterozygous G to C transversion, at codon 7, resulting in Tryptophan (W) replacing Serine (S) in case of the mutant allele this mutation lies inside the HMG box. Three Cases showed an insertion of A, at codon 180, resulting in Arginine (R) replacing serine (S) (This mutation lies outside the HMG-box of the SRY gene), whereas 1 case showed a mutation of A to C at position 93 (This mutation lies outside the ORF of the SRY gene) resulting in Threonine (T) replacing Asparagine (N). Conclusion: The present study revealed that, both cytogenetic and PCR techniques are reliable and efficient techniques in diagnosis and workup of DSD patients when used in combination. Another interesting finding is that genotype/phenotype and sex of rearing are not always in accordance in patients with DSD. Massive heterogeneity of SRY gene mutations was observed in the present study, and the missing SRY gene mutations suggest important role of autosomal genes in DSD and should be looked up in future studies. XIII المستخلص مقدمة يعتبر مرض إختلال التنميط النوعى من الامراض المعقدة والتى تحدث نتيجة خلل فى التركيب الصبغى او الغدد الجنسية مما يؤثر علي الاعضاء التناسلية والمظهر الجنسي الخارجى. حسب الاحصائيات العالمية تبلغ نسبة الاصابة بالمرض 5000:1 مولود جديد. تشير التقارير والدراسات الى ارتفاع هذه النسب فى اوساط اليهود وسكان امريكا الجنوبية (الهسبانك) ولكن وللاسف الشديد فإنه لا توجد إحصائيات دقيقة عن اعداد االمرضى فى السودان. على الرغم من إكتشاف الجين المتحكم فى النمط الجنسي (SRY (فى العام 1990 بواسطة العالم سنكلير يظل فهمنا محدودا للطفرات المصاحبة لهذا الجين ودور الجينات الاخرى فى خلل التنميط النوعى. هدفنا فى الدراسة الحاليه ان نحدد الخصائص السريرية والطفرات الصبغية عند مرضى التنميط النوعى السودانيون كما هدفت الدراسة الى تحديد واستكشاف طفرات الجين (SRY (عند مرض إعتلال التنميط النوعى ذوى الصبغيات الذكورية XY,46 لدى المرضى السودانين ومن ثم إستكشاف العلاقات بين الطفرات والحالة السريرية للمريض. العينات وطرق البحث ضمت الدراسة الحالية 60 مريضا سودانيا يعانون من اختلال التنميط النوعى حيث تم أخذ 10 مليمترات دم تم تقسيمها ووضعت 5 مليمترات فى انبوب يحتوى على الهبارين الملحى لاجراء فحص الصبغيات وتم حفظ المتبقى من الدم فى أنبوبة تحتوى على EDTA لكى يتم استخلاص الحمض النووى منها لاحقا. ا على ً قبل الشروع فى الدراسة طلبنا من كل المرضى التوقيع على إقرار الموافقة على المشاركة فى البحث وذلك بناء الموافقة التى حصلنا عليها من لجنة أخلاقيات البحث العلمى بجامعة النيلين. تم تزريع خلايا الدم الابيض وفحص الكرموسومات بالطريقة المتعارف عليها اما كتابة النتيجة فقد تمت وفقا لموجهات الجمعية الوطنية للمصطلحات الصبغية (1995 .(استخدم الجوانيدين كلوريد لاستخلاص الحمض النووى وتقنية التسلسل البلمرى لدراسة جين ال SRY بإستخدام الكاشف النووى XES10 و XES11 كما استخدمت تقنية الالكتروفوريسيس بإستخدام الجلى بتركيز 1 .%تمت قراءة الشفرة الوراثية لجين ال SRY لمرضى اختلال التنميط النوى XY,46 وذلك تم تحليل النتائج إحصائيا بإستخدام برنامج 13 SPSS حيث تم إعداد التحليل الوصفى للمعلومات الوصفية بالدراسة. ً لتحديد الطفرة فى هذا الجين. النتائج أظهرت نتائج الدراسة الحالية أن 65 %من المرضى الستون قد شبوا كنساء فى حين أن 35 %شبوا كرجال كما تراوحت اعمار المرضى بين شهرو 45 عاما. حوالى 3.63 %من المرضى تقدموا للعلاج بعد البلوغ فى حين تقدم 7.36 %قبل البلوغ وأظهرت النتائج ان 60 %من المرضى كانوا يعانون من تشوهات فى شكل الاعضاء التناسلية الخارجية فى حين كان 30 %يعانون من غياب الدورة الشهرية و 10 %يعانون من أعراض متنوعة. فحص الصبغيات اظهر أن7.61 %يحملون الصبغ XY,46 أما الذين يحملون الصبغ XX,46 فقد مثلوا حوالى 7.31 % فى حين أظهرت النتائج أن 7.6 %كانوا يجملون صبغيات غير طبيعية متمثلة فى التركيب الصبغى 6XY,4/XX,46 .45,XO/46,XX و 47,XYY; أظهرت الدراسة التوافق التام بين الجنس الذي تربوا عليه والتركيب الصبغى فى7.61%من المرضى كما أظهرت الدراسة التضارب بين الاثنين فى3. 38 %من الحالات. 3 . 33 % من الحالات حملوا التركيب الصبغى XY,46 و شبوا كنساء وعانوا من عملية ختان الأناث.أظهرت الدراسة التوافق التام بين التركيب النمطى والتركيب الصبغى فى4 .18% من المرضي البالغين.عند تحليل الصفات الجنسية الثانوية أظهرت الدراسة غياب هذه الصفات الجنسية الثانوية فى 6.42 % من المرضى البالغين. تحليل الطفرات المصاحبة للجين SRY أظهرت وجود الجين عند 60 %من الحالات حيث حمل 7.51 %التركيب الصبغى XY,46 و 5 %لديهم تركيب صبغى XX,46 و 3.3 %لديهم تركيب صبغى مزدوج XY,46/XX,46 .فى حين شكل غياب الجين فى 40 %من الحالات حمل 6.26 %التركيب الصبغى 46XX و 10 %حملوا التركيب الصبغى .45,XO/46,XX أو 47,XYY الصبغى التركيب حملوا% 1.7 و 46,XY أظهرت نتائج التشخيص أن 66 .13T61 %يعانون من 13Tخلل فى النمط الجنسى من النوع XY,46 من هولاء تم تشخيص 5 %كمتلازمة سوير و33.3 %شخصوا كمتلازمة المبيض الخصوى. أما بالنسبة للخلل الجنسى XX,46 والذى شكل 33.33 %فقد شكل 13Tخلل 13T6 تكون 13T6الغدد التناسلية 5 %من المرضى بعضهم من الخلل الكلى و من الخلل الكلى والمصاحب XIV 13Tمتلازمة تيرنر عانى 7.6 %بالاضافة الى 5 %الذين ثبت أنهم يعانون من متلازمة انعكاس الجين بسبب إزفاء الجين من% 5.الخصوى المبيض كمتلازمة شخصوا المرضى من 13T %13T 1.7.(SRY T gene translocation13) الصبغى المرضي شخصوا كخلل تنميط نوعي مرتبط بتركيب كرموسومي غير طبيعي . دراسة تسلسل الحمض النووى أظهرت تغيير فى قاعدة واحدة فى 7 من الحالات,شملت 5 طفرات جينية جديدة كانت الطفرة هيتروزاجوس فى حالاتان أدت الى إحلال T و G فى الكودون 71 مما أدى الى إحلال (A (Alanine مكان (S (Serine محدثا طفرة داخل ال box HMG .بالنسبة للحالات التى أظهرت طفرة من النوع الهيترزجوزيتى فقد ظهرت طفرات فى أربعة حالات في كل من ال G و A عند الكودون 132 أدت الى احلال ال (A (Alanine بواسطة (V (Valine محدثا طفرة داخل ال box HMG كما فى الطفرات السابقة. بالاضافة لهذا فقد اظهر التحليل ثلاث طفرات اخرى من النوع الهيتورزجوزتى فى 3 حالات شملت G و C عند الكودون السابع مما حدا بتغيير ال Serine (S (الى (W (Tryptophan محدثا طفرة داخل ال box HMG .ثلاث حالات اخرى أظهروا طفره بإضافة A فى الكودون 180 محدثا طفرة خارج ال box HMG نتج عنة إحلال (S (serine بواسطة (R (Arginine .طفرة أحرى وجدت فى كودون 93 حدث فيها إحلال C بواسطة A مما نتج عنه إحلال (N (Asparagine بواسطة Threonine (T . (محدثا طفرة خارج ال ORF لجين SRY. الخلاصة أثبتت الدراسة الحالية أن فحص الصبغيات والتسلسل البلمرى من الفحوصات الهامة والتى يعتمد عليها فى تشخيص مرضى خلل التنميط النوعى لا سيما إذا تم إستخدام الاثنين معا. كما أظهرت الدراسة أن التركيب الصبغى والجسمانى لا يتوافق دائما مع التثبيت الجنسي عند الولادة لدى مرضى خلل التنميط النوعى. أثبتت الدراسة أن هنالك تنوع فى طفرات جين SRY عند مرضى التنميط النوعى كما نبهت هذة الدراسة الى أهمية الجينات الاخرى كمسبب لخلل التنميط النوعى الامر الذى يحتاج الى دراسات مستقبلية لتحديد هذا الدور.