Comparative Studies of Chemical Constituents and Genetic Profiles of Seed of Four Gossypium sp varieties BY Nada Makki Abdallh Mostafa M.Sc in Biology (Microbiology) A thesis submitted to the University of ALNeelain in fulfillment of the requirements of the degree of Ph.D.in Biology (Plant Physiology) Department of Biology & Biotechnology Faculty of Science & Technology ALNeelain University Supervisor: Prof. Mawahib ElAmin Mohamed ElNour

Abstract

Abstract The aim of this study was to compare chemical constituents, gossypol content and genetic profiles of seeds oil extracted from three varieties of Gossypium hirsutum L. and variety of Gossypium barbadense L. Cotton seeds used in this study were obtained from the Agricultural Research Corporation (ARC), Wad Medani, Sudan. Seed oils methanolic extracts of Gossypium hirsutum varieties and Gossypium barbadense were screened for their accumulated primary and secondary compounds. The total protein Gossypium hirsutum varieties range (25-22%), while G. barbadense ‘Barakat 90’ was recorded (18%). All four varieties showed low starch content. Flavonoids gave high amount by all varieties. High amount of saponins, steroids and terpenoids were determined from petroleum ether extracts of all varieties. The methanolic and petroleum ether extracts of varieties of seeds tested for their antioxidant activity using DPPH. The antioxidant activity was observed in highest concentration (0.5mg/ ml) of the tested samples. Significant differences (P ≤ 0.05) were detected among different antioxidant potential of G. hirsutum and G. barbadense seeds extracts. Methanolic extracts of seeds of all varieties. were recorded low antioxidant activity. The highest scavenging activity was obtained from the petroleum ether extract from G. hirsutum ‘Hamid’ 63.0 ± 0.12. The content of total phenols in all tested seeds extracts varieties was low. The highest flavonoids content was observed in methanolic extract of seeds of different varieties. Gossypol content in four varieties of cotton grown in Sudan using thin layer chromatography was determined. The varieties of Gossypium sp content gossypol in the seeds oil extract. Physicochemical properties analyses were carried out using standard analytical methods. Results of physical properties showed that the specific gravity at 25C0 were 6.33± 0.12 , 5.18±0.12, 6.73±0.12 and 6.87±0.13 for G. hirsutum ‘ Abden’ , G. hirsutum ‘Seni 1’, G. hirsutum ‘Hamid’ and G. barbadense ‘Barakat 90’ respectively, whereas the refractive index at 25C0 were 1.470±0.21 and 1.474±0.24 for G. hirsutum ‘ Abden’ and G. hirsutum ‘ Seni 1’ , and 1.470±0.24 & 1.475±0.12 for G. hirsutum L.‘Hamid’ and G. barbadense L.‘Barakat 90’ in order. The Density (g/c3) of seed oils were 0.884±0.25 and 0.914±0.29 for G. hirsutum ‘Abden’ and G. hirsutum ‘Seni1’ ,0.935 and 0.939 for G. hirsutum L.‘Hamid’ and G. barbadense L.‘Barakat 90’ in order. pH was 6.25 & 6.42 for G. hirsutum ‘ Abden’ and G. hirsutum ‘ Seni 1’ and 6.76 & 5.76 for G. hirsutum L.‘Hamid’ and G. barbadense L.‘Barakat 90’ in order. The chemical properties of seeds oils of G. hirsutum ‘ Abden’ G. hirsutum ‘ Seni 1’, G. hirsutum ‘Hamid’ and G. barbadense ‘Barakat 90’ are as follows; acid values (mg KOH/ g) 8.1±0.12, 14.1±0.12,7.1±0.01and 20.3±014, free fatty acids (%) 4.0 ±0.11,7.1±0.12,3.3±0.12and 10.3±0.13, peroxide values (meq/Kg fat) is zero in all varieties, saponification value (mg KOH/g) 191±0.01, 194 ±0.01, 188±0.01and195±0.02 and iodine value (I/g oil) 112.8±0.01, 109.9±0.01,113.6±0.01 and 110.4±0.01. The fatty acid profile of seed oils of four varieties were revealed using the gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) technique. The unsaturated fatty acids of G. hirsutum L. ‘Abden’ seed oils were oleic acid 21.27% and linoleic acid 35.43%, while the saturated were palmitic acid 27.87 % and methyl stearate acid (stearic acid) 5.05%. Comparatively, the unsaturated fatty acids of G. hirsutum ‘Seni1’ were oleic acid 25.50 % and linoleic acid 15.61 %, whereas the saturated were palmitic acid 46.07% and methyl stearate (stearic acid) 5.11%. The unsaturated fatty acids of G. hirsutum ‘Hamid’ seed oils were oleic acid 13.11% and linoleic acid 44.25%, while the saturated were palmitic acid 29.16 % and methyl stearate acid (stearic acid) 5.06%.The unsaturated fatty acids of G .barbadense L. ‘Barakat 90’ were oleic acid 22.63 % and linoleic acid 9.65 %, whereas the saturated were palmitic acid 40.12%, methyl stearate (stearic acid) 7.18%. Random Amplified polymorphic DNA (RAPD) markers were used to determine the diversity and relationships among the four varieties of Gossypium spp. The resulted application of the markers 42 bands with 61% polymorphisms and 27 bands with 39% monomorphic.

المستخلص هدفت الدراسة الى مقارنة المكونات الكيميائية ومحتوى الجوسيبول والصفات الجينية لزيت و بذور ثلاثة أصناف من القطن الامريكي وصنف واحد من القطن المصرى . تم الحصول على بذور القطن المستخدمة فى الدراسة من هيئة البحوث الزراعية، ود مدنى ، السودان. تم فحص المستخلصات الميثانولية ومستخلص الايثر البترولى فى الاصناف الامريكية الثلاثة والصنف المصرى وتحديد نسبة البروتين والنشا كمواد اولية وكذلك تحديد المواد الثانوية الموجودة فى المستخلصات المذكورة . تراوحت نسبة البروتين الكلي فى الاصناف المريكية (22-25%) بينما سجل صنف بركات المصرى (18%). جميع الاصناف الاربعة تحتوى على نسبة منخفضة من النشا. سجلت المواد الفلافونويدات كمية عالية فى جميع الاصناف ،وتم تحديد الاسيتيرويدات والتيربينات فى مستخلصات الايثر البترولى ومستخلص الميثانول فى جميع الاصناف . تم إختبار مستخلصات الايثر البترولى فى أصناف القطن الامريكي والقطن المصري لتحديد نشاطها كمضادات اكسدة باستخدام طريقة DPPHومقارنتها مع نسبة تثبيط Propyl gallateالقياسية لنشاط ازالة الجذور الحرة DPPH .أعطى تركيز(0.05مجم /مل) للعينات المختبرة اعلى نسبة لمضادات الاكسدة. تم تحديد فروق معنوية P ≤0.05)) بين مختلف مضادات الاكسدة لمستخلصات النوعين المصرى والامريكي. المستخلصات الميثانولية مستخلصات الايثر البترولى لجميع الاصناف سجلت نشاط منخفض كمضادات للاكسدة عدا الصنف حامد الذى سجل نسية 63.0±0.12 من مستخلص الايثر البترولى. محتوى الفينولات الكلى فى جميع اصناف مستخلصات البذور المختبرة منخفضا بينما كانت نسبة الفلافونويد عالية في جميعها. تم تحديد محتوى الجوسيبول فى الاصناف الاربعة المزروعة فى السودان باستخدام كروماتوجرافيا الطبقة الرقيقة ووجد ان الاصناف الاربعة تحتوى على الجوسيبول فى مستخلص زيت البذور .تم إجراء تحليلات الخصائص الفيزيائية والكيميائية للزيوت المستخلصة باستخدام الطرق التحليلة القياسية . أظهرت نتائج الخواص الفيزيائية ان الثقل النوعى عند درجة 25 درجة مئوية كانت 6.33± 0.12 , 5.18±0.12, 6.73±0.12 and 6.87±0.13 لكل من صنف عابدين وصنف الصينى وصنف حامد وصنف بركات على التوالى . فى حين ان معامل الانكسار عند 25 درجة مئوية كان 1.470±0.21 و 1.474±0.24 بالنسبة لصنف عابدين والصيني 1.470±0.24 و 1.475±0.12 لصنفي حامد وبركات بالترتيب.وكانت الكثافة (جم/ج3) لزيوت البذور 0.884±0.25 and 0.914±0.29 لصنفي عابدين والصينى و 0.935 0.939 لصنفى حامد وبركات بالترتيب .وكان الرقم الهيدورجينى 6.25 و6.42 لكل من صنفي عابدين والصيني و6.76 و5.76 لصنفي حامد وبركات .اما الخواص الكيمائية لزيت البذور للأصناف الامريكية والصنف المصري كمايلى: القيم الحمضية (mg KOH/ g) 8.1±0.12, 14.1±0.12,7.1±0.01and 20.3±014 لصنف عابدين والصيني وحامد صنف بركات. اما الاحماض الدهنية الحرة % 4.0 ±0.11,7.1±0.12, 3.3±0.12 و 10.3±0.13، وقيم البيروكسيد((meq/Kg fat) كانت صفر فى جميع الاصناف ، قيم التصبن (mg KOH/g) 191±0.01, 194 ±0.01, 188±0.01 و195±0.02 ) ، وقيمة اليود (I/g oil) 112.8±0.01, 109.9±0.01,113.6±0.01 و110.4±0.01 ) . باستخدام تقنية الكروماتوجرافيا الغازية لقياس الطيف الكتلى(GC-MS) تم تحديد ونسبةا الاحماض الدهنية المشبعة وغير المشبعة. وكانت الاحماض الغير مشبعة فى زيت بذور صنف عابدين كمايلي حمض الاوليك 21.27% و حمض اللينوليك 35.43%, اما الاحماض الدهنية المشبعة حمض البالمتيك27.87 % و حمض السيتريك 5.05%. مقارنة مع صنف الصيني كانت الاحماض الغير مشبعة حمض الاوليك 25.50 % و حمض اللينوليك 15.61 % بينما الاحماض المشبعة حمض البالمتيك 46.07% و حمض الستيريك 5.11% . اما الاحماض الهنية الغير مشبعةلصنف حامد حمض الاوليك 13.11%و حمض اللينوليك 44.25% ، بينما الاحماض المشبعة حمض البالمتيك 29.16 % وحمض الستيريك ) 5.06%. . بينما الاحماض الدهنية الغير مشبعة فى صنف بركات حمض الاوليك 22.63 % وحمض اللينوليك 9.65 % , بينما الاحماض المشبعة حمض البالمتيك 40.12% وحمض الستيريك 7.18% . وتم قياس الاختلاف فى المادة الوراثية او التركيب الجينى بين الاصناف الاربعة باستخدام RAPD markers. تم اختبار 15 نوع من primers .